1.1 Það sem forfeður okkar vissu

Það sem forfeður okkar vissu

Námstakmarkanir

Í lok þessa kafla muntu geta:

Lýst því hvernig forfeður okkar bættu matvæli með notkun ósýnilegra örvera
Lýst því hvernig orsakir veikinda og sjúkdóma voru útskýrðar í fornöld, áður en smásjáin var fundin upp
Lýst helstu sögulegum atburðum sem tengjast fæðingu örverufræðinnar

Klínísk sjónarmið

1. hluti

Cora, 41 árs lögfræðingur og tveggja barna móðir, hefur nýlega þjáðst af slæmum höfuðverkjum, háum hita og stífum hálsi. Eiginmaður hennar, sem fylgdi Coru til læknis, segir að Cora virðist einnig vera ringluð á köflum og óvenju syfjuð. Byggt á þessum einkennum grunar lækninn að Cora gæti verið með heilahimnubólgu, hugsanlega lífshættulega sýkingu í vefnum sem umlykur heilann og mænu.

Heilahimnubólga getur átt sér nokkrar hugsanlegar orsakir. Hún getur stafað af bakteríum, sveppum, veirum eða jafnvel viðbrögðum við lyfjum eða snertingu við þungmálma. Þótt fólk með veiruheilahimnubólgu jafni sig yfirleitt af sjálfsdáðum, eru heilahimnubólga af völdum baktería og sveppa mjög alvarlegar og krefjast meðferðar.

Læknir Coru fyrirskipar mænuástungu til að taka þrjú sýni af heila- og mænuvökva (CSF) úr mænunni (Mynd 1.2). Sýnin verða send á rannsóknarstofur á þremur mismunandi deildum til prófunar: klínískri lífefnafræði, örverufræði og blóðmeinafræði. Sýnin verða fyrst skoðuð með berum augum til að ákvarða hvort heila- og mænuvökvinn sé óeðlilega litaður eða skýjaður; síðan verður vökvinn skoðaður í smásjá til að sjá hvort hann innihaldi eðlilegan fjölda rauðra og hvítra blóðkorna og til að athuga hvort einhverjar óeðlilegar frumugerðir séu til staðar. Á örverufræðistofunni verður sýnið skilið í skilvindu til að þétta allar frumur í botnfalli; þetta botnfall verður strokið á smásjárgler og litað með Gram-litun. Gram-litun er aðferð sem notuð er til að greina á milli tveggja mismunandi gerða baktería (gram-jákvæðra og gram-neikvæðra).

Mynd 1.2 (a) Mænuástunga er notuð til að taka sýni af heila- og mænuvökva (CSF) sjúklings til rannsóknar. Nál er stungið á milli tveggja hryggjarliða í mjóbaki, sem kallast lendarhryggur. (b) Heila- og mænuvökvi á að vera tær, eins og í þessu sýni. Óeðlilega skýjaður vökvi getur bent til sýkingar en þarf að rannsaka frekar til að staðfesta tilvist örvera. (mynd a: breytt útgáfa af verki Centers for Disease Control and Prevention; mynd b: breytt útgáfa af verki James Heilman)

Um 80% sjúklinga með bakteríuheilahimnubólgu munu sýna bakteríur í heila- og mænuvökva sínum með Gram-litun. ¹ Gram-litun Coru sýndi engar bakteríur, en læknirinn ákveður að ávísa henni sýklalyfjum til öryggis. Hluti af heila- og mænuvökvasýninu verður ræktaður – settur í sérstakar skálar til að sjá hvort bakteríur eða sveppir vaxi. Það tekur nokkurn tíma fyrir flestar örverur að fjölga sér í nægilegu magni til að hægt sé að greina þær og rannsaka.

Hvaða tegundir örvera myndu drepast við sýklalyfjameðferð?

[[i:Hoppaðu yfir í next næsta klíníska áherslubox.]]

Flestir í dag, jafnvel þeir sem vita lítið um örverufræði, þekkja hugtakið örverur, eða „sýklar“, og hlutverk þeirra í heilsu manna. Skólabörn læra um bakteríur, veirur og aðrar örverur og mörg skoða jafnvel sýni í smásjá. En fyrir nokkur hundruð árum, áður en smásjáin var fundin upp, var ómögulegt að sanna tilvist margra tegunda örvera. Samkvæmt skilgreiningu eru örverur (e. microorganism) mjög litlar lífverur; margar tegundir örvera eru of litlar til að sjá án smásjár, þótt sum sníkjudýr og sveppir séu sýnileg með berum augum.

Menn hafa búið með – og nýtt sér – örverur mun lengur en þeir hafa getað séð þær. Sögulegar vísbendingar benda til þess að menn hafi haft einhverja hugmynd um örverulíf frá forsögulegum tíma og hafi notað þá þekkingu til að þróa matvæli auk þess að koma í veg fyrir og meðhöndla sjúkdóma. Í þessum kafla munum við kanna nokkur söguleg not örverufræðinnar auk þess að skoða upphaf örverufræðinnar sem vísindagreinar.

Gerjuð matvæli og drykkir

Fólk um allan heim hefur notið gerjaðra matvæla og drykkja eins og bjórs, víns, brauðs, jógúrts, osta og súrsaðs grænmetis alla skráða sögu. Uppgötvanir frá nokkrum fornleifasvæðum benda til þess að jafnvel forsögulegt fólk hafi nýtt sér gerjun (e. fermentation) til að varðveita og bæta bragð matvæla. Fornleifafræðingar sem rannsökuðu leirker úr nýsteinaldarþorpi í Kína komust að því að fólk var að búa til gerjaðan drykk úr hrísgrjónum, hunangi og ávöxtum strax árið 7000 f.Kr. ²

Framleiðsla þessara matvæla og drykkja krefst örverugerjunar, ferlis sem notar bakteríur, myglu eða ger til að breyta sykrum (kolvetnum) í alkóhól, lofttegundir og lífrænar sýrur (Mynd 1.3). Þótt líklegt sé að fólk hafi fyrst lært um gerjun fyrir slysni – kannski með því að drekka gamla mjólk sem hafði hlaupið eða gamlan þrúgusafa sem hafði gerjast – lærði það síðar að beisla kraft gerjunar til að búa til vörur eins og brauð, ost og vín.

The figure on the left shows oval cells with smaller oval cells budding from the larger cells. An arrow points to a mason jar containing a creamy textured thick liquid. Another arrow points to a loaf of bread. — Mynd 1.3 Sýn í smásjá á *Saccharomyces cerevisiae*, gerið sem fær brauð til að hefast (til vinstri). Ger er örvera. Frumurnar vinna úr kolvetnunum í hveitinu (í miðju) og framleiða koltvísýring sem fær brauðið til að hefast (til hægri). (mynd í miðju: breytt útgáfa af verki eftir Janus Sandsgaard; mynd til hægri: breytt útgáfa af verki eftir „MDreibelbis“/Flickr)

Ísmaðurinn og vísbendingar um fyrstu lækningatilraunir

Forsögulegt fólk hafði mjög takmarkaðan skilning á orsökum sjúkdóma og ýmsir menningarheimar þróuðu með sér mismunandi skoðanir og skýringar. Þótt margir hafi trúað því að veikindi væru refsing fyrir að reita guðina til reiði eða einfaldlega afleiðing örlaga, benda fornleifarannsóknir til þess að forsögulegt fólk hafi reynt að meðhöndla sjúkdóma og sýkingar. Eitt dæmi um þetta er Ötzi ísmaðurinn (e. ötzi the iceman), 5300 ára gömul múmía sem fannst frosin í ís Ötztal-alpanna á landamærum Austurríkis og Ítalíu árið 1991. Vegna þess hve vel Ötzi varðveittist í ísnum komust rannsakendur að því að hann var sýktur af eggjum sviporma (Trichuris trichiura), sem gæti hafa valdið honum kviðverkjum og blóðleysi. Rannsakendur fundu einnig vísbendingar um Borrelia burgdorferi, bakteríu sem veldur Lyme-sjúkdómi. ³ Sumir rannsakendur telja að Ötzi kunni að hafa reynt að meðhöndla sýkingar sínar með trénaðri ávexti agarkúfsins (Fomitopsis betulinus), sem fannst bundinn við eigur hans. Þessi sveppur hefur bæði hægðalosandi og sýklalyfjavirkni. Ötzi var einnig þakinn húðflúrum sem voru gerð með því að skera skurði í húðina, fylla þá með jurtum og brenna síðan jurtirnar. ⁴ Vangaveltur eru um að þetta kunni að hafa verið önnur tilraun til að meðhöndla heilsukvilla hans.

Fyrstu hugmyndir um sjúkdóma, smit og einangrun

Nokkur fornsamfélög virðast hafa haft einhvern skilning á því að sjúkdómar gætu smitast með einhverju sem þau gátu ekki séð. Þetta er sérstaklega augljóst í sögulegum tilraunum til að hefta útbreiðslu sjúkdóma. Til dæmis er í Biblíunni vísað til þess að setja fólk með holdsveiki og aðra sjúkdóma í sóttkví, sem bendir til þess að fólk hafi skilið að sjúkdómar gætu verið smitandi. Það er kaldhæðnislegt að þótt holdsveiki sé smitandi er hún einnig sjúkdómur sem þróast hægt. Þetta þýðir að fólk var líklega sett í sóttkví eftir að það hafði þegar smitað aðra.

Hreint vatn og hreinlætisaðstaða eru meðal mikilvægustu þátta heilbrigðra samfélaga. Elstu dæmin um hreinlætiskerfi í þéttbýli eru frá borgum Indusdalsmenningarinnar, Mohenjo-daro og Harappa, sem staðsettar eru í núverandi Pakistan. Borgirnar voru byggðar árið 2500 f.Kr. (fyrir um 4.500 árum) og höfðu flókin kerfi af brunnum, böðum og frárennsliskerfum sem geymdu ferskvatn og fluttu úrgang burt. Um tvö þúsund árum síðar rakti fólk í forngríska menningarheiminum sjúkdóma til slæms lofts, mal'aria, sem þeir kölluðu „mýgandi ódaun“. Þeir þróuðu hreinlætisvenjur sem byggðu á þessari hugmynd. Í Róm byggðu þeir vatnsveitubrýr sem fluttu ferskvatn inn í borgina og risastórt holræsi, Cloaca Maxima, sem flutti úrgang burt og út í ána Tíber (Mynd 1.4). Sumir rannsakendur telja að þessir innviðir hafi hjálpað til við að vernda Rómverja fyrir faröldrum vatnsborinna sjúkdóma.

Figure a is a map of a city containing a stadium, forum, and other structures. Running through the center of the city is a red line. Figure b is a photograph of a corner of a room. There is a trough between the walls and the floor. This trough is covered with stone benches that have large holes (as for a toilet) in the bench. The holes span the top and front of the bench. There are six holes visible in the bench that runs along one side of the image and two more in the bench along the other side. The image does not show the entire room so there are likely more available spots in this room. — Mynd 1.4 (a) *Cloaca Maxima*, eða „Mesta holræsið“ (sýnt með rauðu), lá í gegnum hina fornu Róm. Það var verkfræðilegt undur sem flutti úrgang frá borginni og út í ána Tíber. (b) Þessar fornu salernisgryfjur tæmdust út í *Cloaca Maxima*.

Jafnvel fyrir uppfinningu smásjárinnar tóku sumir læknar, heimspekingar og vísindamenn miklum framförum í skilningi á ósýnilegum öflum – því sem við nú þekkjum sem örverur – sem geta valdið sýkingum, sjúkdómum og dauða.

Gríski læknirinn Hippókrates (e. hippocrates) (460–370 f.Kr.) er talinn „faðir vestrænnar læknisfræði“ (Mynd 1.5). Ólíkt mörgum forfeðrum sínum og samtímamönnum hafnaði hann þeirri hugmynd að sjúkdómar stöfuðu af yfirnáttúrulegum öflum. Þess í stað hélt hann því fram að sjúkdómar hefðu náttúrulegar orsakir innan úr sjúklingum eða umhverfi þeirra. Talið er að Hippókrates og arftakar hans hafi skrifað Hippocratic Corpus, safn texta sem eru meðal elstu læknisfræðirita sem varðveist hafa. ⁵ Hippókrates er einnig oft eignaður höfundur Hippókratesareiðsins, sem nýir læknar sverja til að heita því að helga sig greiningu og meðferð sjúklinga án þess að valda skaða.

Þótt Hippókrates sé talinn faðir vestrænnar læknisfræði er gríski heimspekingurinn og sagnfræðingurinn Þúkýdídes (e. thucydides) (460–395 f.Kr.) talinn faðir vísindalegrar sagnfræði þar sem hann mælti með gagnreyndri greiningu á orsök og afleiðingu (Mynd 1.5). Meðal mikilvægustu framlaga hans eru athuganir hans á Aþenuplágunni sem varð þriðjungi íbúa Aþenu að bana á árunum 430 til 410 f.Kr. Þar sem Þúkýdídes lifði faraldurinn af gerði hann þá mikilvægu athugun að þeir sem lifðu af smituðust ekki aftur af sjúkdómnum, jafnvel þótt þeir önnuðust fólk sem var veikt. ⁶ Þessi athugun sýnir snemmbúinn skilning á hugtakinu ónæmi.

Marcus Terentius Varro (116–27 f.Kr.) var afkastamikill rómverskur rithöfundur sem var einn af þeim fyrstu til að setja fram þá hugmynd að hlutir sem við getum ekki séð (það sem við köllum nú örverur) geti valdið sjúkdómum (Mynd 1.5). Í Res Rusticae (Um landbúnað), sem kom út árið 36 f.Kr., sagði hann að „einnig verði að gera varúðarráðstafanir í nálægum mýrum
. . . því þar vaxa ákveðnar örsmáar verur [animalia minuta] sem ekki sjást með berum augum, sem svífa í loftinu og komast inn í líkamann gegnum munn og nef og valda þar alvarlegum sjúkdómum.“ ⁷

Öldum síðar byggðu íslamskir fræðimenn, aðallega í Persíu, á þekkingu Hippókratesar auk kínverskra og indverskra lækninga. Fremstur þeirra var Abū Bakr al-Rāzī, yfirleitt nefndur al-Razi eða með latnesku nafni sínu, Rhazes. Hann þróaði ýmsar tilraunaaðferðir til að prófa mismunandi þætti læknisfræðinnar. Til dæmis, til að velja staðsetningu fyrir sjúkrahús, hengdi al-Razi upp hrátt kjöt víðs vegar um borgina og staðsetti sjúkrahúsið á þeim stað þar sem kjötið var lengst að rotna. Hann var einnig sá fyrsti til að greina á milli mislinga og bólusóttar og gerði tilraunir til að ákvarða hvaða meðferðir sem í boði voru væru árangursríkastar fyrir hvorn sjúkdóm. Þótt al-Razi hafi ekki haft tæknina til að skilja hlutverk örvera, hafði viðleitni hans til að bera kennsl á orsakir sjúkdóma, frekar en að einblína eingöngu á einkennin, mikil áhrif.

Íslamskir læknar sköpuðu eitt mikilvægasta læknisfræðirit sögunnar, Canon of Medicine (arabíska: al-Qānūn fī al-Ṭibb). Alfræðiritið var tekið saman árið 1025 af lækninum og heimspekingnum Ibn Sina (oft nefndur Avicenna) og innihélt ítarlegar lýsingar á líkamshlutum, nákvæma lýsingu á yfir 800 lækningaefnum og meinafræði nokkurra sjúkdóma, flokkað eftir líkamshluta eða heilsufarsatburði. Í verkinu lýsti Ibn Sina smitleiðum, gaf til kynna að lífverur gætu smitast af utanaðkomandi efnum og að sjúkdómar gætu borist með andardrætti. Honum er einnig eignaður heiðurinn af því að hafa þróað þá venju að einangra veikt fólk og lagði þar með grunninn að sögulegum og nútímalegum sóttkvíaraðferðum. Canon var þýtt á mörg tungumál og var aðalheimildin við kennslu í læknisfræði um allan heim, allt fram á endurreisnartímann og lengur.

Figure a is a drawing of a bust of Hippocrates. Figure b is a photo of a sculpture of Thucydides’s head. Figure c is a photo of a sculpture of Marcus Terentius Varro. — Mynd 1.5 (a) Hippókrates, „faðir vestrænnar læknisfræði“, taldi að sjúkdómar hefðu náttúrulegar, ekki yfirnáttúrulegar, orsakir. (b) Sagnfræðingurinn Þúkýdídes tók eftir því að þeir sem lifðu af Aþenupláguna voru síðan ónæmir fyrir sýkingunni. (c) Marcus Terentius Varro setti fram þá kenningu að sjúkdómar gætu orsakast af „ákveðnum örsmáum verum . . . sem ekki sjást með berum augum.“ (c: breytt útgáfa af verki eftir Alessandro Antonelli)

Fæðing örverufræðinnar

Þótt menn til forna hafi ef til vill grunað tilvist ósýnilegra „örsmárra vera“ var tilvist þeirra ekki endanlega staðfest fyrr en með uppfinningu smásjárinnar. Þótt óljóst sé hver nákvæmlega fann upp smásjána var hollenskur klæðakaupmaður að nafni Antonie van Leeuwenhoek (1632–1723) sá fyrsti til að þróa linsu sem var nógu öflug til að sjá örverur. Árið 1675, með einfaldri en öflugri smásjá, gat Leeuwenhoek fylgst með einfruma lífverum, sem hann lýsti sem „dýrlingum“ eða „litlum kvikindum“ sem syntu í regndropa. Af teikningum hans af þessum litlu lífverum vitum við nú að hann var að skoða bakteríur og frumverur. (Við munum kanna framlag Leeuwenhoeks til smásjárfræða nánar í How We See the Invisible World.)

Næstum 200 árum eftir að van Leeuwenhoek sá örverur í fyrsta sinn leiddi „gullöld örverufræðinnar (e. golden age of microbiology)“ af sér fjölda nýrra uppgötvana á árunum 1857 til 1914. Tveir frægir örverufræðingar, Louis Pasteur og Robert Koch, voru sérstaklega virkir í að auka skilning okkar á hinum óséða heimi örveranna (Mynd 1.6). Pasteur, franskur efnafræðingur, sýndi fram á að einstakir örverustofnar hefðu sérstaka eiginleika og sýndi að gerjun stafaði af örverum. Hann fann einnig upp gerilsneyðingu, aðferð sem notuð er til að drepa örverur sem valda skemmdum, og þróaði bóluefni til meðferðar á sjúkdómum, þar á meðal hundaæði, í dýrum og mönnum. Koch, þýskur læknir, var fyrstur til að sýna fram á tengslin milli einnar, einangraðrar örveru og þekkts sjúkdóms í mönnum. Hann uppgötvaði til dæmis bakteríurnar sem valda miltisbrandi (Bacillus anthracis), kóleru (Vibrio cholera) og berklum (Mycobacterium tuberculosis). ⁸ Við munum fjalla nánar um þessa frægu örverufræðinga, og aðra, í síðari köflum.

Figure a is a drawing of Louis Pasteur in his lab. Figure b is a photograph of Robert Koch. — Mynd 1.6 (a) Louis Pasteur (1822–1895) er eignaður heiðurinn af fjölmörgum nýjungum sem fleyttu örverufræði og ónæmisfræði fram á við. (b) Robert Koch (1843–1910) greindi þær tilteknu örverur sem valda miltisbrandi, kóleru og berklum.

Eftir því sem örverufræðin hefur þróast hefur hún gert líffræðinni, sem víðara fagi, kleift að vaxa og dafna á áður óímyndaðan hátt. Mikið af því sem við vitum um frumur manna kemur frá skilningi okkar á örverum og mörg þeirra tækja sem við notum í dag til að rannsaka frumur og erfðafræði þeirra eru sprottin af vinnu með örverur.

Tengsl við örverufræði

Verkfærakista örverufræðinnar

Þar sem stakar örverur eru yfirleitt of litlar til að sjást með berum augum er örverufræðin háð tækni sem getur á tilbúinn hátt aukið getu náttúrulegrar skynjunar okkar. Fyrstu örverufræðingar eins og Pasteur og Koch höfðu færri verkfæri til umráða en finnast á nútíma rannsóknarstofum, sem gerir uppgötvanir þeirra og nýjungar enn áhrifameiri. Í síðari köflum þessa texta verður farið ítarlega yfir mörg not tækninnar, en í bili er hér stutt yfirlit yfir nokkur af grundvallarverkfærum örverufræðistofunnar.

Smásjár búa til stækkaðar myndir af örverum, frumum og vefjum úr mönnum og mörgum öðrum tegundum sýna sem eru of smá til að sjást með berum augum.
Litunarefni og litir eru notuð til að lita örverur svo hægt sé að skoða þær betur í smásjá. Sum litunarefni er hægt að nota á lifandi örverur, en önnur krefjast þess að sýnin séu fest með efnum eða hita fyrir litun. Sum litunarefni virka aðeins á ákveðnar tegundir örvera vegna munar á efnafræðilegri samsetningu frumna þeirra.
Æti eru notuð til að rækta örverur á rannsóknarstofu. Sum æti eru vökvar; önnur eru í föstu eða hálfföstu formi. Æti veitir næringarefni, þar á meðal vatn, ýmis sölt, kolefnisgjafa (eins og glúkósa) og köfnunarefnis- og amínósýrugjafa (eins og gerþykkni) svo örverur geti vaxið og fjölgað sér. Hægt er að breyta innihaldsefnum í æti til að rækta sérstakar tegundir örvera.
Petrískál er flöt skál með loki sem er yfirleitt 10–11 sentímetrar (cm) í þvermál og 1–1,5 cm á hæð. Petrískálar úr plasti eða gleri eru notaðar til að geyma æti (Mynd 1.7).
Tilraunaglös eru sívalningslaga plast- eða glerrör með ávölum botni og opnum toppi. Hægt er að nota þau til að rækta örverur í seyði, eða hálfföstu eða föstu æti.
Bunsenbrennari er málmtæki sem myndar loga sem hægt er að nota til að dauðhreinsa búnað. Gúmmíslanga flytur gas (eldsneyti) að brennaranum. Á mörgum rannsóknarstofum er verið að leggja Bunsenbrennara af í þágu innrauðra örbrennsluofna, sem þjóna svipuðum tilgangi án þeirrar öryggisáhættu sem fylgir opnum loga.
Sáningarlykkja er handverkfæri sem endar í lítilli vírlykkju (Mynd 1.7). Hægt er að nota lykkjuna til að draga örverur á agar í Petrískál eða til að flytja þær úr einu tilraunaglasi í annað. Fyrir hverja notkun verður að dauðhreinsa sáningarlykkjuna svo ræktanir mengist ekki.

Mynd 1.7 (a) Á þessa Petrískál, fyllta með agar, hefur verið dregin Legionella, bakterían sem veldur hermannaveiki. (b) Hægt er að nota sáningarlykkju eins og þessa til að draga bakteríur á agar í Petrískál. (mynd a: breytt útgáfa af verki Centers for Disease Control and Prevention; mynd b: breytt útgáfa af verki Jeffrey M. Vinocur)

Neðanmálsgreinar

Rebecca Buxton. „Examination of Gram Stains of Spinal Fluid—Bacterial Meningitis.“ American Society for Microbiology. 2007. http://www.microbelibrary.org/library/gram-stain/3065-examination-of-gram-stains-of-spinal-fluid-bacterial-meningitis ↩
P.E. McGovern o.fl. „Fermented Beverages of Pre- and Proto-Historic China.“ Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1 nr. 51 (2004):17593–17598. doi:10.1073/pnas.0407921102. ↩
A. Keller o.fl. „New Insights into the Tyrolean Iceman's Origin and Phenotype as Inferred by Whole-Genome Sequencing.“ Nature Communications, 3 (2012): 698. doi:10.1038/ncomms1701. ↩
Capasso, L. „5300 Years Ago, the Ice Man Used Natural Laxatives and Antibiotics.“ Lancet (London, England) bindi 352,9143 (1998): 1864. doi:10.1016/S0140-6736(05)79939-6 ↩
G. Pappas o.fl. „Insights Into Infectious Disease in the Era of Hippocrates.“ International Journal of Infectious Diseases 12 (2008) 4:347–350. doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijid.2007.11.003. ↩
Þúkýdídes. Saga Pelópsskagastríðsins. Önnur bók. 431 f.Kr. Þýtt af Richard Crawley. http://classics.mit.edu/Thucydides/pelopwar.2.second.html. ↩
Plinio Prioreschi. A History of Medicine: Roman Medicine. Lewiston, NY: Edwin Mellen Press, 1998: bls. 215. ↩
S.M. Blevins og M.S. Bronze. „Robert Koch and the ‘Golden Age’ of Bacteriology.“ International Journal of Infectious Diseases. 14 nr. 9 (2010): e744-e751. doi:10.1016/j.ijid.2009.12.003. ↩